【实验指南】如何保证微生物检验中数据完整性

　　市场上销售的药品和设备的质量标准包括了关键微生物质量属性，其目的在于确保疗效和病人的安全。最终产品、原材料和中间产品的取样、微生物检验以及数据的解释都是为了最大程度的保证成品的质量。传统培养微生物方法具有固有的和不可避免的误差范围，这可能导致得出错误的产品质量结论。这些误差相互关联，且与数据完整性问题有着内在的联系；监管机构鼓励制造商进行更多分析测试人员或增加检查频率的方式以防止此类误差的发生。理解微生物检验的误差对真正解决数据完整性问题是至关重要的。此外，除了提高微生物实验室检查能力外，一系列有意义的预防策略也是可行的。该简短综述中描述了法规要求、固有的微生物学误差变量，和现实的行动以及能真正确保病人安全的活动。

　　【海螺研习社观点】：微生物检查的误差范围受到较多因素的干扰，药监当局本身允许和鼓励对微生物测试安排多人多次的测试（类似与一般化检的重复测试）来尽可能排除微生物测试中固有的误差，但是这样的操作本身看上去和我们一般理解的数据完整性是有区别的，所以需要针对这一特殊的测试类型进行单独的讨论，尽可能来区分哪些是为了降低误差进行的合理测试，哪些是为了“复测”而复测。

　　当然数据完整性还包括那些应该按照规定操作而实际并未进行的操作，这类问题的发现和预防是挑战QA和审计人员的能力的另一种表现，本文中并未涉及这个方面的问题讨论，而身处国内的检查人员不得不自己摸索行之有效的检查方法了。

　　导言

　　药政当局规定须评估药品和设备的微生物质量 (美国联邦法规21 CFR 211和800章节以及EU Eudralex 第四卷)。这些法律旨在确保接受治疗的病人不受掺假药品和设备的潜在微生物影响。这种掺假可被视为外来污染，例如，应为无菌的物品实际不是无菌、含有带一定数量或某些种类（致病菌）微生物（生物负荷）的非无菌药物。微生物质量属性是无菌和非无菌产品的实际检测技术和相关可接受标准，定义可以参见各监管当局认可的药典。根据药监当局的标准对成品或设备进行评估，并确定其是否适合上市。同样，药典也详细介绍了参考、参考方法或分析测试方法，即根据微生物标准对药物或设备进行取样、检验和评估(或提供可采用的替代方法)。保证药物的微生物质量不仅仅是基于最终产品的取样、测试和评估；而是建立在对工艺所用物料 (原材料、添加剂、加工助剂)、工艺中间体(包括中间步骤，例如中间体的存放)和环境取样、测试和评估的完整、连续的整体计划之上。对取样、检验和评估进行完整、综合和科学的管理，才能提供完整的微生物数据，来确定产品是否符合批准的标签要求。现行GMP（例如21 CFR Parts 211.110 和211.113）也规定必须获得每一批成品或设备的从头到尾的监控检测数据。

　　【海螺研习社观点】：由于微生物检测的特殊性，产品的微生物属性的确认就不再是“最后成品取样检测”那么一个点了，而是存在在整个涉及微生物的过程中，全过程的概念给数据完整性的获得提出了挑战。QA人员必须有这样的全局观，才可以有效的评估产品的微生物风险。

　　将药政当局的要求、确定的微生物属性、取样、测试和分析目的结合考虑，以更好地确保病人的安全。确保病人安全是成品药和设备供应的根本指导原则和道德准则。行业和监管机构在这一点上是完全一致的。同样，提供安全的治疗并且确保患者在微生物质量方面的安全也受益于以下认识:

　　对于生物负荷和无菌测试而言，实验获得的数据很难真实的控制、解读或调整。历史上，法规主要依靠从分析检查中获得的数据作为病人安全的证明。这是可以理解的，因为司法系统是基于证据支持的。事实上，注重设计和控制可以更好地保证产品的微生物质量 (如ICH Q8药物开发、Q9质量风险管理、Q10药物质量体系、Q11原料药开发和生产)。使微生物检测数据有意义只是实现微生物产品质量的总体设计、控制、检查和平衡的大目标的一部分。

　　获取微生物数据依赖于对样品进行特定测试。只有获得具有代表性的样品，才能获得有意义的微生物数据，才能支持证明设计工艺得到了控制、最终产品满足所需的微生物属性。不仅必须保证样品为被测材料的真品，即在取样过程中不受污染，而且必须在与试验目的相符的地点和时间(工艺控制或符合微生物特性的材料)进行取样。通常情况下，最差的取样时间是在任何工艺的结束阶段。此外，样品必须具有材料的代表性，也是可导致均匀性差的原因。基于真正理解微生物风险和控制而进行的端到端综合取样计划是实现这一目标的方式。

　　【海螺研习社观点】：取样的合理性和代表性决定了检测结果的科学性，这里提到了最差的取样时间点，提到了样品的保存状态，提到了样品本身的均一性能，也提到了取样方案和方法本身对样品的潜在影响。从数据完整性的角度来看，这些环节都可能带来数据的缺失或是失真，结果就是对检测结果带来科学上的质疑。

　　每个样本都受特定检验方法的约束，对检验方法应进行适当的方法开发、方法确认和相应的控制。检验的执行在很大程度上取决于相关标准操作程序(SOP)的完善性和微生物人员的智慧。

　　【海螺研习社观点】：检测方法本身的科学性也是一个重要要素。

　　对样品进行检验后，并对微生物数据进行解释，然后进行微生物评估。传统的微生物测试方法总是依赖于对液体或固体培养基进行目测，或者对菌落形成单位(CFUs)计数，或者评估是否存在CFUs，或者是液体培养基中是否浑浊。CFU计数最多是主观的估计结果，因为唯一能够形成菌落的细胞是那些能够在测试条件下生长的细胞。这些测试条件包括培养温度、培养时间、培养基类型、氧气条件等。

　　【海螺研习社观点】：检测结果的评价、解读和解释也是一个重要环节，这个环节传统上过多的依赖于个人而非客观的设备仪器，所以数据完整性的漏洞大多出现在这个环节。而影响评价体系的周边要素也一直是传统微生物实验室接受官方检查会被重点挑战的因素，而在数据完整性的框架下，这些点也是现场检察官突破口之一。

　　随后记录的CFU数量不是原始数据，CFU计数是微生物人员对碟子上菌落数量的解释，但易受存在菌落数量的影响; 当数值过高时，由于在碟子表面的汇合或过度拥挤而导致计数误差; 数值太少时，因为CFUs遵循泊松分布，所以就会出现误差。

　　【海螺研习社观点】：由于微生物测试的本性也决定了计数原则存在一定的误差和偏离，太多或是太少都会是产生误差的来源。科学的排除这些干扰因素也是微生物人员素质的体现。

　　最近几个管理当局检查了申请GMP的微生物检验的公司，并签发了检查缺陷信。这些缺陷包括：只有一个微生物人员通过视觉观察进行检验，并对结果进行解释。例如，有药监机构称CFU计数错误。这可能是由于光线或放大倍数不当、未使用合适的计数设备、稀释倍数错误等原因造成的。这些缺陷项被归类为数据完整性问题。因此，人们普遍认为，安排多个微生物人员是针对微生物数据完整性问题的迅速有效的预防措施。初步可能会认为这是最合适的整改; 然而，它并不是一种普遍作法，也没有必要。实际上可能会阻碍我们实现降低患者风险以及最大限度地提高患者安全的共同目标。

　　【海螺研习社观点】：这个例子体现了回复缺陷的时候的整体考虑欠缺，这也是本文的出发点，当你的设施被挑战在微生物测试上存在数据完整性缺陷的时候，单纯的安排复测或是单纯的就事论事讨论可能往往是不正确的。因为整改的方向应该是基于科学的系统分析来进行，这也是本文的核心讨论价值点。

　　以证据为基础的司法体系和立法建立在无可争辩的数据(法律证据或证据规则)之上，这有助于很好地为制药行业服务；然而，它与公认的微生物数据的固有可变性不太相符，这类可变性可分为两类：

　　a)可避免的变异-由于操作不当而导致的变异

　　b)固有的不可避免的变异-由于方法的局限性和生物样品处理的不确定性导致的可变性

　　保证微生物质量不能主要靠试验数据而实现。协调微生物检验限制、设计控制的微小细节和对这些测试的解释性评估以及取样之间的关系，常常显得异常困难。有必要确保收集到的用于证明工艺控制和产品符合微生物质量属性的数据尽可能准确; 然而，除了多个微生物人员进行检查和评估外，还有许多其他方法可以实现这一点。这篇简短的综述旨在说明基于培养的微生物检验方法的固有变异性(但不能降低其重要性)，并为避免潜在的数据完整性问题提供了一系列备选方案。

　　【海螺研习社观点】：这段话比较确认的说明了本文的主要目的：即通过分析目前微生物测试方法的固有误差项目来提供为回复官方数据完整性质疑的可能方向。这样的讨论基于的点是希望可以通过相对科学的原理来说服官方接受一个行业和监管当局都可以妥协的方案来处理潜在的“数据完整性”问题。这也是本文的讨论范围和出发点，这样的讨论是否被各国监管当局接受实际还很难说，我们介绍本文的目的也是希望可以激发国内业界的意见和建议，看看如何平衡好这两类可变性（即有效的区分真实的操作不当和分析方法本身不可避免的误差）。

　　微生物质量属性

　　所有成品药和医疗器械必须符合其适用用途，基于适当的质量标准获得上市许可，精心设计和控制的生产工艺应符合法规及cGMP要求。对于成品药，这意味着必须有适当安全性、鉴别、规格、纯度和质量特性。微生物(活性和非活性)、它们的产物、或其内在的生化和生理活性在治疗中可能会对安全性、规格、纯度和质量产生不利影响。与无生命的化学或物理杂质或污染物不同，微生物的活性和动态性对产品适用用途和最终病人的安全构成了更大的风险。一定数量的某些微生物在药品容器中被引入时可能引起感染；活性微生物的代谢活动可以改变药物产品的配方，导致化学变化或药效的改变。最后，微生物的残留或脱落的细胞和细胞膜可能会引起热原或毒性效应。因此，成品质量标准中包括微生物的检验可以说是最重要的，而且不能低估它们对使用者病患人群产生的不利影响。同时，药典也明确规定了药物成品的微生物质量标准。美国药典(USP <71>无菌检查)、欧洲药典 (EP 2.6.1 无菌)、和日本药典 (JP 4.06无菌检查)都规定了所有肠道外给药药物产品必须进行无菌测试。允许非无菌药物根据剂型和给药途径有一定量的生物负荷，分别在美国药典<1111>(非无菌产品的微生物检验：药物制剂和物质的可接受标准)、EP 2.6.12 (非无菌产品的微生物检验：总数、好氧菌计数)和JP 4.05 (微生物限度检验)中规定。微生物对治疗的潜在影响是无可争议的，显然是病人安全的一个风险来源；然而，我们必须认可行业标准药典中所描述的生物负荷的精确质量标准。USP 1111、EP 2.6.12和JP 4.05列出了不同剂型的药物产品中生物负荷的最高限值，定义为总好氧微生物计数(TAMC)和总酵母菌和霉菌计数(TYMC)，分为10 CFU、100 CFU和1000 CFU。 每个药典随后都对这些最大生物负荷限值进行了确认，三个药典(USP、EP、JP)均规定：“微生物质量的可接受标准解释为：101 CFU：最高的可接受数量=20；102CFU：最大的可接受数量=200；103 CFU：最高的可接受数量=2000；等等”。

　　所有的药典都认可微生物学和微生物具有固有变异性；都预期由专业微生物人员来恰当地解释这些数据。200%的偏差是可允许的；实质上CFU计数接受两倍差异或变异。因为微生物的固有动态性质、微生物种群、以及样品处理和以培养为基础的方法，这种变异性是必要的。这同样适用于工艺输入(原材料、添加剂、加工助剂)、工艺中间体(包括中间保持等工艺步骤)和环境测试。对已确定的微生物质量属性进行计数是质量保证的一个重要组成部分，但也存在着公认的变异性。除了微生物质量属性外，药典还对生物负荷计数或确定是否存在的标准检验方法进行详细说明。公认这些方法是一种判定或参考方法，一家公司需要对其每一种样品配方进行优化和确认，以确保任何可培养(使用所述培养基和条件)微生物的回收率：微生物学质量控制(QC)实验室检验。

　　【海螺研习社观点】：这段话对于熟悉微生物检测的读者来说有点多余，是重复的！

　　QC微生物检验

　　一般采用统一的参考药典和鉴定微生物试验方法对材料进行评价，以获得必要的微生物质量属性。按照基于生长的培养方法进行检验，可以确定存在或不存在微生物，也可以计算生物负荷。按照USP<62> (非无菌产品的微生物检验:特定微生物检验)、EP 2.6.13(非无菌产品的微生物检验:特定微生物检验)、JP4.05 (微生物限度检验)、USP 71、EP 2.6.1和JP 4.06，可检验是否存在微生物; 基于对培养基的检查，获得是否存在微生物的物理可见特征。相比之下，按照USP<61> (非无菌产品的微生物计数试验:微生物计数试验)、EP2.6.12 (非无菌产品的微生物计数试验:微生物计数试验)和JP4.05 (微生物限度试验)进行的微生物计数试验，通过检查回收的离散菌落对材料进行评估。类似的非药典生物负荷试验方法可用于工艺输入(原材料、添加剂、加工助剂)、过程中间体(包括过程步骤，如中间过程储存)和环境监测样品中的微生物计数。以下两部分简要介绍了药典无菌试验、微生物计数试验和非药典生物负荷试验方法，讨论了它们的限制条件和与潜在数据完整性有关的基本微生物事实。

　　无菌检验

　　在统一的药典无菌试验中，由训练有素的专业微生物人员进行观察，而不是由仪器进行观察并记录。这种评价方式可能会产生误解和不一致的区分结果，并可能导致错误的无菌检查结论。由于微生物人员需要在视觉上评估是否存在浑浊，可能会出现错误。这就要求，微生物人员除了拥有良好的视力和合适的光源外，还要了解微生物生长的变异性。当残留产品与培养基发生反应而造成浑浊时(与膜过滤法相比，直接接种法受到的影响更大)，就会出现问题。由操作者来决定是否浑浊。存在残骸是辨识浑浊和微生物生长的一个潜在问题; 这来源于产品的人造橡胶胶塞、培养基和漂洗液瓶。

　　【海螺研习社观点】：这里解释了传统的无菌测试的判定原则严重依赖于人力主观的判断。

　　无菌是指产品及其给药途径所决定的某些治疗方法(药物、生物和设备)所要求的微生物质量属性。美国法律21CFR 200.50和21CFR 200.51分别规定，在美国市场上所有注射剂产品(皮肤、皮下和肠外)、眼科和水性口吸入产品都必须是无菌的。根据USP<1211>（灭菌和无菌保证的补充条款），治疗的无菌性被定义为“无菌的最严格定义是指，只有在完全没有可存活微生物的情况下，样本才会被认为是无菌的”。长期以来迄今为止患者人群、监管机构和制造商都使用这一定义和类似的定义，以实现患者安全的首要目标。但这未考虑到其重要的科学缺陷、与现代微生物学的不一致性，以及无可争议的事实：不能通过产品测试统计意义上或技术上 (无菌检验)进行验证。EP、JP和USP根据USP <71>、EP 2.6.1和JP 4.06确定了精确统一的检验方法。无菌定义的关键要素之一是“完全没有”一词，由此推断出任何声称是无菌的物品中都彻底完全没有微生物。萨顿说明了没有一种测试能够证明生产批次中对标有“无菌”的产品的无菌性进行统计保证。尽管无菌检查存在技术缺陷和统计上的限制，但该定义和无菌检查在确保病人安全方面仍具有效用，并且是一项立法要求。

　　CFR第211部分成品药GMP中颁布了cGMP条例。21 CFR第211部分关于无菌和无菌检验的立法要求在21 CR Part 600-680中得到补充。《21 CFR第211.165(b)部分》引用了无菌微生物质量属性的要求，该部分规定:“每批药品必须进行适当的实验室检测，不得有有害微生物”。在这里，“有害”是指在无菌产品中任何可存活的微生物(目前的无菌定义)。更具体地说，21 CFR第211.167(a)部分指出，“每一批声称无菌和/或无热源的药物，应进行适当的实验室检测，以确定是否符合这些要求。”试验程序应采用书面形式，并应遵照执行。

　　【海螺研习社观点】：介绍了法规中关于“有害菌”的定义和规定，实质并未改变“无菌”的概念本身要求。

　　尽管申报参数放行已获批(见USP<1222>参数放行)，但常常仍有必要进行无菌检验。即使在特殊情况下也适用，例如21 CFR第211.165(A)部分：“如果对特定批次的短期放射性药物进行无菌和/或热原测试，可在完成无菌和/或热原检验前放行这些批次，前提是尽快完成检验”。

　　除了立法规定无菌物品必须进行无菌检查外，CFR也要求进行任何适用于此目的的试验。21 CFR第211.165部分（D）：“质量控制单元进行取样和检验的可接受标准应确保药品批次符合每个适当的质量标准和统计质量控制标准，作为其批准和放行的条件。统计质量控制标准应包括适当的接受水平和/或不合格水平。

　　【海螺研习社观点】：参数放行的概念本来寄希望于可以避免检测和实际误差的存在不可调和的矛盾，但是实际操作中也不得不依赖无菌检测来做为一个重要判定指标。

　　就统一的无菌性检验而言，强调了公司的程序必须清楚地区分怎样合格，怎样不合格。无菌检验依赖于专业微生物人员的视力情况，以及明确无菌检验套筒中生长的情况。这些标准根本上取决于一个人在微生物学方面的能力和资格(经验和专门知识)。如果正确按照21 CFR第211.165(E)部分，那么它强调一家公司必须描述和建立无菌检验的区分能力，因此微生物人员：“公司应建立所采用检验方法的准确性、敏感性、特异性和重复性，并做好记录。这些确认和文件可按照211.194(a)完成。”

　　此外，21 CFR Part 211.160(b)中很清楚，任何检验相关的仪器应进行校准、维护，并应确保是否符合既定的质量标准：“按照既定的书面程序对仪器、仪器、仪表和记录装置进行校准，其中包括具体的指示、计划表、准确度和精密度的限度，以及准确度和精密度超标时的补救措施规定。任何不符合既定质量标准的仪器、设备、仪表和记录装置都不能投入使用。”

　　为了对无菌检验结果正确解释，确保使用一致的判定方法需要微生物人员的视觉敏锐度和专业胜任能力。

　　【海螺研习社观点】：介绍了不得不接受的现状：方法科学准确、文件规定规范、记录完整、仪器适合用途且状态完好、微生物检测人员的专业和敏锐。类似于“元数据”是定义“数据”的完整背书，以上这些要素变成了定义“无菌检测”的完整背书要素，脱离了这些要素的某次“无菌检测结果”实际意义不大，换句话说，一旦被法规当局质疑微生物检测的数据完整性了，那么就要这些背书要素进行完整的梳理和确认。而本质上可以变更这一现状的矛盾的新技术，一定是可以兼容或是更好追溯这些背书要素的方法或技术。

　　业界和监管机构广泛认可无菌检验，因为它具有两个基本的约束条件。首先，无菌检查的检测限大于单个活细胞。微生物的生理、基因型和表型变异本质上保证了无菌检验只能回收(培养)一小部分潜在的污染物; 有些微生物由于培养基的限制而无法培养，而另一些微生物由于其生理上的特性而无法培养。其次，无菌检查不具有统计意义基础。

　　Odlaug使用下面的公式1来证明II型误差——一假阴性的概率，也就是说，不能识别染菌情况。

　　P= 1- e-λ            (1)

　　其中，P是无菌试验失败的概率(阳性结果)

　　e = 2.7182818

　　λ=受污染单位的概率

　　按照公式1并且假设至少1个微生物才能染菌，那么一批中取样20个单位（n=20）检测到染菌单位的概率情况请见表1。显然，所有单位均污染（表1第一列中100%）时，无菌检验阳性的概率是100%，即能识别出染菌单位。同时根据表1，该批中污染单位的频率是1%时，无菌检验阳性能检测出染菌单位的概率才有18%。

　　通过无菌检验来达到无菌保障是不够的，这在监管者和业界都是公认的，因为它只能够检测到严重的污染事件。无菌检查对于保证微生物质量、降低病人的风险，并且最大限度地提高病人安全方面的贡献价值，对综合生产设计和控制来说是微不足道的。事实上，第二个微生物人员肉眼来检查无菌并不能保证检验微生物的生长情况，也无助于提高我们确保无菌的几率。有许多方法帮助解决无菌检验相关的数据完整性问题（见下文）。

　　【海螺研习社观点】：我们不能用统计学的方法去判定是否无菌，但是我们却只能使用统计学的公式来预测无菌保障的程度，不得不说这也是一种“悖论”。

　　微生物计数和生物负荷检验

　　按照药典微生物计数法对样品的微生物水平进行评估，以及按照非药典生物负荷检验对物料的微生物水平进行评估，是制药工艺控制的重要部分。在大多数制药工艺中，在特定阶段对中间体产品进行取样（基于风险评估的阶段，旨在告知我们工艺风险和效期）。进行生物负荷检验可以从上游工艺追踪到下游，我们期望微生物水平有所下降，或至少微生物水平保持不变，只要低于可接受限度即可。对于无菌产品，我们期望终端过滤前样品的微生物水平不会过高而挑战过滤器的灭菌能力。

　　生物负荷是指某一物质(或表面)在特定时间点的微生物含量。可能是在灭菌之前的微生物含量，或与效期有关的微生物含量。除了提供最终产品和物料放行(微生物计数测试)所必需的数据外，生物负荷计数(例如，环境监测和过程测试)还可确定以下方面的长期趋势：

　　(a)超过警戒或行动限的样本

　　(b)总数或平均数的变化

　　(c)回收微生物形态特征的变化

　　微生物计数和生物负荷测试通常采用平板计数法；也许是采用倒琼脂平板法，也许是(由于样本较大)采用膜过滤更好。在所有情况下，回收的离散菌落被量化为CFU。这些方法本质上具有固有变异性。

　　用平板计数法需要注意选择合适的琼脂、培养时间和温度，以确保得到最佳回收率，可通过微生物挑战回收率来进行评估。所收集的样本应指定终止时间(需要进行确认)，测试前样品的储存通常为2-8℃，以延缓微生物的生长速度。

　　【海螺研习社观点】：一样先介绍了微生物限度本身的意义、测试方法和基本量化方法。

　　除了如上所述因素，因此用来评估生物负荷的平皿计数方法仍有许多变异因素。第一是培养基的局限性。任何单一的培养基或其培养条件都不能检测到样品中所有可培养的潜在微生物。通过选择通用的培养基(如大豆酪蛋白消化培养基)并在30-35℃下培养72小时或更长时间，倾向于与人类皮肤微生物区系相关的微生物 (如果该群体是最适当的)。在这里，微生物人员将需要考虑关注的群体。在许多情况下，检验条件仍然有利于需氧菌和嗜中温微生物的生长。这是因为这种生物在环境中是很常见的；如果它们污染了产品，往往会成为问题，因为它们最有可能生长，而且大多数人类病原体属于这一类别。

　　其次，正如上面所讨论的，CFU是测试的最终结果，认为其是样本中存活的细菌或真菌细胞数量的估算。大量的微生物复制才能使菌落达到视觉外观; 此外，还不知道菌落来源于单一的微生物还是几个近亲微生物。因此，当菌落计数时，菌落来自一个细胞或1000个细胞是不确定的，重要的是，CFU不是直接精确测量的微生物数量。

　　第三，平皿计数时也可能出现不准确。这里需要区分微生物琼脂板的检测限(假设为1 CFU，但使用常规方法是不可测试的)和定量限(基于可数的范围，这在一定程度上与检测碟的大小成函数)。

　　琼脂板的大小不同，因此有一个最佳计数范围；当微生物数超过最佳的可计数上限(由于汇合或过度拥挤)或低于下限(由于统计精度方面的统计误差，特别是在已进行稀释的情况下)时，就会出现误差(25)。USP <1227>《药物的微生物回收验证》中推荐细菌和酵母(如白色念珠菌)的可计数范围为25-250CFU，对于丝状真菌推荐8-80 CFU。这些是相对于90-100毫米琼脂板说的，对于55 mm板(可能用于膜过滤方法)，可计数范围减少到20-80 CFU。

　　根据Sutton的论述，综合菌落大小、群体行为（包括群聚或分散的影响）、琼脂平板的表面积、以及大量菌落的汇合或过度拥挤的一般效会导致达到区间上限。这些结合因素导致误差假设，在该范围的上限处，观测到的CFU数相对于期望的数字有所下降，并且散度变得足够显著，使得观察到的计数太不精确，而不具有科学价值。

　　同样，在较低的范围内，回收的CFUs模式服从于Jarvis定义的“总误差”，误差就会出现。

　　平板涂布法、倾注平板法和薄膜过滤法的菌落总数相关的总误差可表示为：

　　% 总误差 = ±√（A2+B2+C2）

　　其中，

　　A   %抽样误差

　　B   %分布误差

　　C   %稀释误差

　　这一问题由三种不同的错误来源构成，它们可能单独出现，也可能联合出现。

　　每个误差举例为：

　　● 抽样误差:称量和混合

　　● 分布误差:计数错误和记录误差

　　● 稀释误差:移液体积和稀释体积。

　　这些误差造成的低计数结果遵循泊松分布。

　　第四，进一步的误差可能来源于数字休约舍入或平均。因此，在大多数情况下，通过CFUs估算的微生物数量通常低估了样本中活细胞的数量。相关计数不准确性和误差也可发生在菌落计数操作中。人工通常使用人工光源进行菌落计数，如菌落计数器。

　　第五个问题是微生物的传播，这对菌落计数是个问题。由于菌落重叠难以区分而产生菌落计数误差（例如，重叠）。对于菌落传播，通常有三种不同的类型:

　　1)一种菌落链，不是很明显地分开，似乎是由细菌丛的解体引起的。

　　2)在琼脂和碟子底部之间的水膜中形成的一种类型。

　　3)在琼脂边缘或表面形成水膜的一种类型。

　　因此，微生物计数方法(药典微生物计数法和非药典生物负荷检验)只能以“可能是提供最好的微生物生物负荷指标”为目标，而不是绝对生物负荷。

　　【海螺研习社观点】：以上从五个方面解释了所谓的“微生物限度”方法存在较大误差的科学基础和本质原因，也提供了任何偏离的调查方向。不得不承认的是，所谓的“微生物限度”实际是一个很模糊的概念和大概的数据，并非是真的实际的生物负荷。

　　在采用稀释倒平板法的试验中，也假定了各种变异。通过微生物挑战评估这些方法，其可接受的回收率表示为50-200%。方法确认过程中也需要进行挑战，以证明该方法是合适的，并且任何抗菌物质都已被中和或充分稀释。即使发生这种情况，人们也承认，微生物在试验条件下的回收率是可变的。

　　如上描述的变异在范围内，除此之外，更重要的是与样品处理相关的变异，特别是当它受到离心、旋涡和手工混合等工序影响时。微生物的回收率也会受不同的液体中重新混悬 (如浓缩或稀释步骤)的影响，特别是当液体组成、渗透压、pH或温度与最初的生长条件不同时。

　　在特定的回收率范围内，50-200%的上限范围更有可能是由于移液或稀释的误差造成的，也反映了微生物在一组条件下生长而在另一组条件下不生长的生物复杂性。

　　低限可反映出现偶尔细胞死亡或挑战的微生物损伤，这可能导致回收率下降(随着保存时间可能会增加)。同样重要的是，记住即使在化学定义的培养基中，也没有任何成分是绝对纯净的，这可以导致更进一步的变化。

　　【海螺研习社观点】：不可否认，目前可以接受的50-200%的误差范围实际也就是受限于技术的发展，以及行业的大量默认规则。关注到样品处理带来的误差可能实际比测试本身带来的误差更大这一现实，也就很难去质疑50-200%误差范围的科学性了，理论上看，这也是可以接受的相对严格的标准了。这一事实的推论就是，在这么大的误差范围内发生的数据完整性问题还是真的数据完整性问题吗？倒过来，作者的意图就很明显了，你要先从以上提到的五个方面先去进行详尽的调查，然后排除样品处理和储存带来的误差后才能判定是否真的存在“数据完整性”缺陷。抑或是实际这些调查要素也就构成了某次实际的“微生物限度”测试本身数据结论的“元数据”要素，这些要素的缺失本身就是“数据完整性”的缺失了！

　　确保微生物数据完整性策略

　　因为有根本性的缺陷，无菌和其他微生物检验完全不出现误差是不可能的。但是，与检验相关的潜在数据完整性问题可以得到解决。

　　微生物质量控制检验由一个有资质的微生物人员进行目视检查或对测试结果进行计数，正确判断对结果进行解释或评估，并准确地记录结论。因此，检验的辨识能力依赖于视觉观察和对此的解释。视觉观察和检查都是数据完整性的来源：系统误差或人为诚信问题，这些可以通过许多个别的适当策略来解决。

　　【海螺研习社观点】：这部分开始作者提出了有哪些合适的策略可以降低这些误差，更好的判定数据完整性在微生物实验室的真实存在。我们认为就提到的这些策略来说，本质上并为改变实际的判断“悖论”。或许我们只有在将来真的改善了测试方法和计数方法后才能真的从根本上解决这一“悖论”。【更加科学的判定哪些是人为的诚信问题，那些是系统本身固有的误差范围】

　　药典方法之外的设计

　　Deming曾说过一句著名的话:“检查以发现不合格为目标，然后去除它们，这太迟了、无效且代价高昂。” 质量不是检验出来的，而是来自于过程的改进。监管机构也提出了同样的想法，即从根本上承认检验是一种确保质量的低效手段。参数放行中的无菌检验，则完全消除与该微生物测试相关的潜在数据完整性风险。

　　数据完整性基本上是一个设计上的问题，它允许或提供让人犯错误的机会。由于微生物质量控制检验的固有缺陷，特别是无菌检查，避免进行缺陷检测是去除数据完整性问题、支持cGMP和保证患者最高安全水平的最有效手段。检验设计可以通过多种方式实现。首先，通过适当设计和管理的程序，无菌产品的参数化程序放行为产品无菌提供了最大保证。参数放行在标准USP <1222>以及FDA法规指南中有所描述; 在PDA技术报告30—湿热最终灭菌的药物和医疗器械产品的参数放行也有涉及。

　　对于采用参数放行程序来替代无菌检验的企业，必须向主管监管机构提出申请递交文件并得到批准，从而达到既定的标准和指南要求。参数放行是一种非常好的产品放行方法。目前按照21 CFR第211.165(a)和21 CFR第212部分，产品放行的参数程序适用于那些终端灭菌的产品以及特定的短寿命放射性药物。后一种情况下，生产设计、管理和控制的其他促成要素全部通过非终端灭菌工艺来提供无菌保证并应获得批准。到目前为止，其他生产无菌药品非终端灭菌工艺也可能出现在即将出现的标准起重要作用，为参数放行提供候选代表。

　　参数放行程序的替代方法采用与USP <1223>《替代微生物方法的验证》等效的现代测试方法，并且消除了视觉灵敏度和基于结果的判断解析的因素。市场上已出现了几个体系，并且其中一些体系已经成功实施。

　　【海螺研习社观点】：作者认为参数放行可以从系统上根源上解决传统无菌测试固有的“悖论”，从全系统的范围去背书整个“无菌”结论本身的数据判断。也提出了替代微生物方法等最新的快速检测技术，不容置疑，这也代表了技术的发展方向和法规当局的科学态度。遗憾的是，这类体系的应用和技术的完善目前还达不到尽善尽美，就编译者感觉，“参数”本身的选择就很有挑战，要选择有代表性的参数来证明这些参数是无菌结论相关联的本身就存在很大的困难。如果在结合产品特性和微生物本身的特性，实际目前工业界所谓的“参数放行”一样存在传统方法“悖论”的局限性，或许我们期待的“参数放行”和我们实际可以做到的“参数放行”鸿沟还需要工程技术人员持续不断的努力才可以解决。

　　改进检验方法

　　对药典方法进行工艺改进是可行的，可帮助微生物生长可视化：无菌试验中的浊度和琼脂平板法的CFU。机器、激光和光学技术可帮助微生物人员或完全不需微生物人员进行视觉辨别和评估微生物生长。使用数字化图像的技术进行评估，不仅提供了作出检验结论的手段，而且还提供了记录、存档、参考和检索数据的手段，实现了数据完整性的完整要素。微生物人员的视觉识别也可以得到显著改善：通过提供照明系统和灯箱(环境白光比黄灯提视觉敏感性更好)和简单的增强功能来消除人为误差，从而减少误差、偶然未识别到微生物生长或准确计数。在整个测试方法生命周期中，谨慎的做法是建立和维护记录方法开发(包括图像存档和支持信息)的设计历史文件或等效文件。

　　【海螺研习社观点】：这一方案实际是计划采用机器或是其他原理来替代微生物分析测试人员的主管判断，这个也是一样的，需要建立相关性，需要建立历史数据和经验数据来证实，这些工作也不是一朝一夕可以实现的，而且即便你建立起来了，用起来了，估计也要花很大精力去向监管当局解释这个合理性和科学性。可能去美国的企业可以尝试，在中国和欧洲监管下的企业最好不要去尝试这一方案。

　　提高人员知识和技能

　　无论质量体系或检验方法的复杂程度如何，主流文化、个人知识和专业技能都是确保cGMP的最重要方式。无论是在集菌培养器还是在琼脂板上，培训、知识管理和教育对提高辨别微生物生长的视觉特征所必要的经验和专门知识至关重要。

　　微生物人员应获取检验基本知识和原理、以及检验方法设计历史文件中的信息(特别是存档的图像)，是解决数据完整性问题最有效、最快捷和最高效的方法之一。某些产品配方具有固有的物理或化学特性(例如疫苗中的铝盐佐剂)，可能掩盖对生长的视觉识别，或可能错误地解释为微生物生长，这种情况并不少见。交互式知识管理程序和图像库在防止数据完整性问题方面非常有效。

　　【海螺研习社观点】：这一方案可能是目前企业可以采纳的最佳方案，这也是译者反复强调的无菌设施真的是需要关注“人”的，其实无论“悖论”存在的程度如何，诚实的质量文化，专业的质量原则，以及熟练的质量技巧或许才是我们显示可以努力实现的。

　　持续专家确认

　　还必须利用专业培训方案一起进行初始和持续的资格认证，不仅确保微生物人员具评估资格，而且要定期确认这一能力，并确保向微生物人员提供检验相关的新信息(作为检验方法生命周期和设计历史文件的一部分)。这类培训可包括评估微生物人员利用浊度标准(如按McFarland标准配制的溶液)识别浊度的能力，或用一系列微生物挑战肉汤培养，以显示不同培养基中的不同生长模式(例如，链球菌在胰蛋白胨大豆肉汤中的生长与液体硫乙醇酸盐培养基的生长非常不同)。随着年龄的增长视力不可避免而下降，因此建议定期重新评估。另一个是色盲测试，对于区分一些微生物鉴定测试和革兰氏染色的红-蓝光谱非常重要。与任何测试一样，如果对数据的解释有任何可疑之处，那么将自动引发程序化的评估升级，由更多有资质的微生物人员或依赖其他技术进行评估。

　　【海螺研习社观点】：这一方案有时候会被企业过度强调或是误用于证明自己多么科学或是多么有资历。我们认为这一方案应该整合到上一个方案中去，毕竟专家培训方案和一般从业人员的培训方案本质是一样的，不应该强调其中任何一方，毕竟实际双方引入的系统误差概率是一样的，一旦引入误差其性质也是同等严重的。

　　趋势与分析

　　日常彻底得对微生物数据进行趋势分析和评价，虽然主要是为了监测生产绩效控制，但也可评估和辨识出潜在的数据完整性问题。对微生物学数据进行评估，可识别出可能源于数据完整性问题的任何不一致之处。当定期安排多个微生物人员进行检验、检查和解释结果时，这是解决潜在的数据完整性风险的一种特别强有力的方法。

　　【海螺研习社观点】：如果基础数据是真实的，那么这个方案就是目前可以采用的最可靠的方案之一。或许我们不能用统计学的工具去解释某一次的微生物测试，但是显然，这些工具可以用于分析和解读一个固有设施长期检测数据的趋势。毕竟误差如果是默认的，范围也是确认的，超出趋势的数据点就肯定意味着什么！而在趋势范围内的任何看上去异常的单个数据点，或许也只是整体误差的正常波动。微观微生物限度“测不准原理”在大量累计数据的趋势下，并不会妨碍我们对宏观产品微生物属性的判定，甚至可以借助特殊的数据分析方法和方案，从大量的趋势下甄别出哪些是人为的误差，哪些是系统固有的误差，这个方面编译者认为是更有显示价值的突破口。

　　第二个人复核

　　包括第二个人复核（另外一名具备同等或更好专业技术和培训以进行视觉检查和解释结果的微生物人员），使视觉观察和得出结论的人数加倍，也许有人会说，这为结果进行正确解释提供了额外的保证; 然而，这本身就是一个有缺陷的论点，因为任何评估根本上都取决于进行评估的人的能力。如果培训和知识管理计划不够完善，那么，无论有多少微生物人员来复核检验都是没意义的。换句话说，这种方案只有在视力、经验和知识都足够的情况下才能有效，但没有解决个人或组织恶意有意为之的问题，如果他们确定要篡改数据，那么总会找到方法。

　　【海螺研习社观点】：如果是编译者本人，或许我们会从检测人员的其他行为来做为突破，结合一些明显的外在的要素，比如打卡记录，通勤记录，日常行为参数，心理访谈等等来侧面证明原测试人员的诚信有问题，然后再安排第二人符合。在没有评估完第一人的本质原因之前的任何第二人的复核测试实际都是对自己系统的否认，这个方案尽可能在实际操作中采用。

　　讨论

　　按照cGMP下产生的数据必须保证可追踪、清晰、同步、原始及准确。这五个方面要求与英国药品保健品管理局、FDA指南、WHO附件5和PIC/S指南所描述是一致的，并且在整个生命周期内必须保证数据的五个要求。虽然这些关键因素是有形的、易于测量和评估的，但数据完整性本身体现了组织文化。此外，无论组织的质量管理体系、工艺、系统设计是否充分，组织文化总是会使工艺和体系得到好的平衡或者更之混乱。以前许多微生物质量控制检验方法一直依赖于经验丰富的微生物人员，他们以良好的判断力进行目测或计数结果，并准确记录检验结论。历史存在乃至现在仍然存在很容易出现我们现在所说的问题的机会或步骤。如今对于我们在这些试验中定义为“数据完整性”的问题，还有很多提升的空间。他们对数据完整性问题的敏感性无疑与组织文化有着不可分割的联系；然而，在整个制造过程中和保证微生物质量属性方面的实际影响、重要性仍有待评估。

　　数据完整性问题来源来自于跨系统误差、真正个人失误、个人渎职和机构渎职。药典判断无菌检验的性质及依赖于对检验结果的视觉检查或计数，使用良好的判断力并准确地记录检验结果的结论，在整个数据完整性(系统误差、真正个人失误、个人渎职和机构渎职)中都是合适的。微生物检验非常容易发生在有动机故意伪造、篡改或伪造数据的组织或个人身上，而且随着FDA等机构加强数据完整性方面的执法活动，这些正成为人们关注的焦点。我们讨论了微生物检验中潜在的数据完整性问题，这些检验与系统误差或个人的诚实错误有关。这些意外的错误可归因于人为错误(如视力)、疏忽或粗心。

　　【海螺研习社观点】：数据完整性的本质进一步进行了阐述，说实话，问题表现在实验室，而问题的本质肯定不在实验室！我们的经验也更多的告知我们如果一个工厂存在数据完整性的问题，那么肯定是最高管理层的质量理念和企业质量文化存在问题。我们或许从现有技术上很难甄别微生物实验室数据完整性缺陷的“悖论”，但是好的审计人员很容易从其他方面“直觉”的感受到他/她看到的微生物数据是否真的值得信任，剩下的就是他/她如何去证明自己的“直觉”罢了。就编译者自己的经验来说，这样的判定法则会比之前的任何方案更加有效，这可能也是目前人类特有的技能，AI一段时间内还不能取代现场审计人员的原因吧。

　　毋容置疑cGMP通过立法和指南规定了最低要求，包括美国食品药品化妆品法、21 CFR 210、211、600以及ICH Q7。数据完整性是cGMP的基石，因为没有可依赖的数据，对制造过程或产品质量方面就更没有信心。数据完整性问题(无论是已知的、未知的、有意的还是无意的)本身可能掩盖其他问题；对组织文化进行有效的诊断，则代表了一种有形的手段。通过这种手段，管理当局可例证出组织内的基本问题。无菌检测或许只是其中的一个选择，尽管几十年来检验合格，没有出现对病人安全产生广泛有害影响的事例，但易出现数据完整性问题的特点。

　　一般来说，所有微生物质量控制检验方法本质上都是多维度的，这些维度包括但不限于数据关键性和数据风险、检验速度与准确性和精确性的对立性、质量管理体系、知识管理和技术。图1说明了微生物质量控制检验方法处于不同位置的这些维度。

　　1 微生物质量控制检验方法的多维度（改编自32）。

　　CQA:关键质量属性

　　CPC: 关键工艺控制

　　IPC/其他：中间过程控制

　　QMS：质量管理体系

　　对每项检验绘制这两个维度间的关系，可以评估确定是否需要解决某些微生物检验方法相关的潜在数据完整性问题。基于这样的理解，生产企业就可以通过重新设计检验、改进、加强人员能力或第二个人复核来确定适当的行动方案（如有必要），以解决潜在的数据完整性问题。不管微生物质量控制检验方法如何，针对数据完整性采取的活动必须对保证患者整体安全有所帮助。

　　【海螺研习社观点】：维度框架很好的构建了，对于企业来说如何应用和把控又取决于QA和现场核查人员个人的能力。我们或许很难在目前给出大家更多的直接而且有效的解决方案，本文也就是一个思考，或许您有更多的建议和经验，欢迎随时和海螺研习社联系交流，共同提高。

来源：海螺研习社主编 海螺研习社